免疫疗法是当下肿瘤治疗领域最具前景的发展方向之一。随着PD-(L)1等免疫检查点抑制剂应用范围逐渐扩大，CAR-T疗法研究不断出现新的进展，CAR-T疗法作为有别于传统药物的“活药”，不仅对复发、难治性肿瘤患者表现出了突破性疗效，其生产体系和使用场景也有别于普通药物。鉴于生物技术的快速发展，预计CAR-T疗法将带给人们更多惊喜。
CAR-T疗法是什么
CAR-T（Chimeric antigen receptor T cell，嵌合抗原受体T细胞）疗法是指通过基因修饰技术，将带有特异性抗原识别结构域及T细胞激活信号的遗传物质转入T细胞，使T细胞直接与肿瘤细胞表面的特异性抗原相结合而被激活。T细胞被激活后，一方面通过释放穿孔素、颗粒酶素B等直接杀伤肿瘤细胞；另一方面通过释放细胞因子，募集人体内源性免疫细胞来杀伤肿瘤细胞，以达到治疗肿瘤的目的。同时，还可形成免疫记忆T细胞，从而获得特异性的抗肿瘤长效机制。
一个典型的CAR-T治疗流程主要分为五个步骤：分离，从癌症患者外周血中分离纯化出自身T细胞；修饰，T细胞激活后，利用基因工程将能特异识别肿瘤细胞的CAR结构转入T细胞；扩增，体外培养，大量扩增CAR-T细胞至治疗所需剂量，一般为十亿至百亿级别（根据患者体重和治疗周期决定）；回输，化疗清淋预处理后回输CAR-T细胞至患者体内；监控，观察疗效并严密监测不良反应。整个疗程持续3周左右，其中细胞“分离-修饰-扩增”约需要2周。
CAR-T的结构
CAR通常由一个胞外抗原结合域（如识别CD19的单链抗体序列scFv），一个铰链区（促进抗原受体与肿瘤抗原的结合），一个跨膜区（用来固定CAR），一个T细胞激活结构域（CD3ζ，提供T细胞活化的第一信号）以及一个或多个胞内共刺激结构域组成（CD28/4-1BB，提供T细胞活化的第二信号）。CAR的胞外抗原结合域源于抗体的抗原结合基序，可以连接VH和VL序列构建的单链可变区，具有特异性识别某种特定肿瘤相关抗原的作用。CAR识别肿瘤相关抗原，随后通过胞内信号传导结构域活化T细胞，刺激T细胞进行增殖，并发挥免疫效应，释放细胞因子，溶解肿瘤细胞。
历经十余年，CAR-T经历了四代结构，每一代结构在各个细节上均有所突破，使CAR-T往更为精准、更为高效、更为持久的方向发展。T细胞的完全激活一方面依赖于胞外抗原结合域与抗原的结合所传递的第一信号，另一方面也需要共刺激分子受体与其配体结合所传递的第二信号，而肿瘤细胞表面通常不表达这类共刺激配体。第一代CAR设计结构相对简单，在临床试验中的效果并不理想。第二代CAR引入一个共刺激结构域CD28或4-1BB，在临床试验中显著改善了CAR-T免疫活性激活的问题，并提高了作用持久性。第三代CAR包含两个共刺激结构域，一个为CD28或4-1BB，另一个为OX40、CD28或4-1BB。相比二代，三代CAR虽然在一些前临床试验数据中表现出更强、更持久的作用活性，但也有报道指出，三代CAR可能会造成T细胞刺激阈值的降低，引起信号泄露，可能诱发细胞因子过量释放。
由于肿瘤细胞具有异质性，一部分肿瘤细胞不具有可被T细胞特异性识别的抗原，无法被传统的CAR-T细胞识别并清除。这一问题或可通过四代CAR-T技术，募集除T细胞以外的免疫细胞至肿瘤所在区域来解决。四代CAR-T细胞又被称为TRUCK T细胞，含有一个活化T细胞核因子（NFAT）转录相应元件，可以使CAR-T细胞在肿瘤区域分泌特定的细胞因子（目前主要是IL-12），从而修饰肿瘤微环境，募集并活化其他免疫细胞进行免疫反应。目前，四代CAR-T疗法已经在包括神经母细胞瘤在内的实体瘤中开展临床试验。
第二代CAR-T有较多的临床数据支持，稳定性高且技术工艺较为成熟，是目前的主流技术。未来，随着新结构在临床上的试验推广及生产工艺的改进，第三代、第四代CAR-T产品更为优良的疗效值得期待。
CAR-T的靶向抗原
CAR-T技术是靶向某一种抗原，而不是针对单一肿瘤疾病，因此靶点的选择是CAR-T有效性和安全性的基础。CAR-T靶向的肿瘤抗原可分为两类：一类是肿瘤特异性抗原，是最理想的抗原。靶点抗原的特异性越高，CAR-T细胞就可越专一地针对特定的肿瘤细胞，对正常细胞不作用，从而降低不良反应。但这种理想的抗原不多，目前受到关注的有表皮生长因子受体EFGRvIII和前列腺特异性膜抗原PSMA等。还有一类是肿瘤相关抗原，其在肿瘤细胞表面过度表达，在正常组织中低表达，目前大部分应用的肿瘤抗原靶点都是这种。
目前应用于临床最成功的案例是以CD19为靶点构建的CAR-T，但其适应证局限在B细胞相关的血液肿瘤中，如B系淋巴细胞白血病（急性、慢性）以及非霍奇金淋巴瘤（弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤等）。
据Cell Trials的统计，截至2017年10月，全球大约50%的CAR-T临床试验针对CD19靶向抗原，另有一小部分（约6%）使用的是由CD19与另一抗原组成的组合抗原。除了CD19，CAR-T在血液肿瘤治疗方面还有许多其他抗原，其中BCMA、CD22、CD20较为常见。BCMA正在成为CAR-T治疗的热门靶点。
2018年中国肿瘤登记年报数据显示，我国发病率最高的前10种癌症均为实体瘤，占全部癌症的比例高达77%。但实体瘤靶点的研发较为困难，相关研发任重道远。目前针对实体瘤，以间皮素为靶点的CAR-T临床试验数量最多，针对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）靶点治疗肝癌、双唾液酸神经节苷脂2（GD2）靶点治疗神经母细胞瘤以及针对CEA靶点治疗肠癌的CAR-T疗法也受到了广泛关注。
CAR-T结构中抗体scFv的筛选
CAR是以抗体的scFv（单链可变区）识别肿瘤抗原的，所以CAR-T的研发需要获取和筛选单抗。筛选出亲和力高的单抗后，将相应的杂交瘤细胞冻存传代形成稳定的细胞株，用于CAR结构中scFv序列的构建。
scFv由重链、轻链以及之间的linker连接而成，所以将不同的重链和轻链随机组合，可以建成人源化的scFv组合抗体文库，再通过表达量、稳定性、与抗原的亲和力等指标进行筛选。高通量筛选主要通过噬菌体展示技术。该技术最大的优点是直接将表达出来的抗体与其基因型联系在一起，再利用抗原-抗体的特异性结合，将感兴趣的抗体挑选出来。通过噬菌体技术，可高效获得scFv人源化片段，提高CAR-T的安全性和有效性。
scFv序列是CAR-T研发中的核心技术，从华创证券的调研信息来看，筛选一个合适的scFv序列，时间成本和费用成本都不低，鼠源性的成本在几十万元，人源化的则需要上百万元。目前很多科研机构使用的序列是从文献上获取的，原则上只能用于科研。所以如果要做创新型CAR-T并进行商业化，则需要科研机构或企业自主研发筛选。
CAR-T的转染载体与制备工艺
为实现CAR在T细胞上的表达，需要通过载体将CAR基因导入T细胞。理想的载体应该具有较高的基因转染效率、稳定性好，不引起机体免疫反应等特点。目前有多种载体用于CAR-T细胞产品制备，包括病毒载体转导（如γ-逆转录病毒载体或慢病毒载体）及非病毒载体转染（如转座子转染、mRNA电穿孔转染）等，虽然已开展的临床试验以病毒载体转导方式为主，但以非病毒载体转染的方式也在获得青睐。
慢病毒载体是目前应用最多的载体系统。病毒基因转移载体的主要优点是制造、生产相对容易，并且能够将遗传物质稳定整合到宿主基因组中。但病毒载体的致病性和潜在的插入诱变可能性在人类临床试验中存在显著的监管障碍，所以非病毒载体的开发显得十分重要。转座子和mRNA电穿孔技术是目前研究比较多的两类非病毒载体系统。转座子最终可能发展成多功能T细胞基因转移系统，但目前的DNA电穿孔方法通常产生较差的细胞活力，临床应用中需要扩大T细胞培养，以产生大量 T 细胞。mRNA电穿孔被认为是目前最安全的T细胞基因转导方法，其可转导静止或增殖缓慢的T细胞，转导效率多在90%以上，且设计相对容易，性价比高。临床上已经使用利用瞬时mRNA转染产生的CAR-T细胞，然而，这种方法需要几轮CAR-T细胞输注。在临床前模型中，mRNA电穿孔转导的靶向间皮素的CAR-T能引起播散性间皮瘤异种移植物的消退，然而，在灌输49天后一名患者出现了过敏反应。
CAR-T细胞的制备需要一些小心操作的步骤，而且整个过程中都需进行质量监控测试。CAR-T的GMP制备工艺主要包括：T细胞收集和分离、T细胞激活和修饰、T细胞扩增、T细胞收获与回输。生产过程通常需要5～10天，从收集到回输需要2～4周（根据患者的临床状态和化疗预处理方案确定）。
CAR-T细胞制造是一个非常复杂的过程，制造难、成本高已经成为行业发展的瓶颈问题。目前，吉利德和诺华公司均采用的是集中生产模式，首先在医院中提取患者的T细胞，然后将这些细胞运送至制造中心，在制造中心对T细胞进行基因工程设计，最后将设计后的T细胞运回医院回输至患者体内。然而，无论使用何种制造模式，成功的CAR-T细胞制造都依赖于端到端流程的优化能力，包括工作流程的简化、产能规划以及生产的可扩展性等等。自动化、全封闭的新一代制造工艺是未来发展趋势，目前市场上已经有一些解决方案，如博雅控股集团旗下的CAR-TXpress、美天旎的CliniMACS Prodigy以及GE公司的FlexFactory 等。（木子鹏）
(责编：郎玥(实习生)、杨迪)
