新发布化学品毒性试验方法简介

　全球化学物产量从1930年的仅仅100万t增加到今天的4亿t。仅在欧盟注册的化学物就有10万多种。每年世界化学物产值大约为115万亿美元, 其中75%的产值来自经济合作与发展组织的成员国, 欧盟和美国化学工业占了世界近60%的产值。2005年中国化学物产值超过德国成为世界第三大化学物生产国, 许多大型跨国公司都在中国建立化学物生产基地, 包括巴斯夫、陶氏化学、壳牌等。

化学物给现代社会带来了许多好处, 比如在工业、食品生产、医药等领域都发挥了巨大的作用。但是也对人类健康和环境造成了严重的损害。

由于世界大部分化学物生产于OECD成员国, OECD早在1971年就开展了环境、健康和安全计划, 要求所有新的化学物都需经过对人类健康和环境的影响及其降解性测试, 对化学物进行安全性评价。为此, 经合组织制定了一套《化学物测试指南》, 并一致同意了16个《良好试验室操作规范》文件。1981年首次颁布20项化学物毒性和生态毒性的测试方法, 随后又陆续颁布了50余项毒性和生态毒性的试验方法。

本文主要对2000年以后该测试指南中增加的毒理学试验方法作一个简要的介绍。

1 　皮肤变态反应试验———局部淋巴结法[

本试验方法颁布于2002年, 根据致敏化学物能诱导接触部位淋巴结淋巴细胞发生增殖反应, 比较受试化学物和对照物质诱导淋巴细胞的增殖情况, 对受试化学物的致敏性进行评估。主要是小鼠尾静脉注入3H2甲基胸腺嘧啶脱氧核苷或125 I2脱氧尿嘧啶核苷放射性同位素, 通过淋巴细胞含有的放射性同位素量检测淋巴细胞增殖的程度。本试验方法可作为化学物致敏性的筛选试验, 初步识别致敏化学物和确定无明显皮肤致敏活性的化学物。受试物出现阳性结果后可采取后续试验如豚鼠试验进行评估。局部淋巴结法最大的优点是减少了动物的使用数量, 而且也不需要豚鼠试验中的最大值反应, 减少了动物的痛苦, 兼顾了动物福利的问题。

2 　体外3T3细胞中性红摄取光毒性试验

本试验方法颁布于2004年, 可作为光毒性动物试验的替代方法, 鉴定光照条件化学物是否诱导产生光毒性, 预测化学物对人体和动物的急性光毒性效应。选用小鼠成纤维细胞系Balb / c3T3细胞, 培养24 h形成单层细胞后添加不同浓度的化学物培养1 h, 在光照条件无细胞毒性的情况下激发化学物产生光毒性反应。光毒性可导致细胞膜和溶酶体发生不可逆性改变, 细胞摄取活体染料中性红的量减少, 根据该原理能够有效区分存活、损伤或死亡的细胞。检测中性红的还原量测定细胞的存活率, 比较有光照和无光照条件下获得的浓度反应预测化学物的潜在光毒性。

3 　化学物经皮吸收试验

检测化学物经皮吸收和皮肤转运的方法主要有两种: 体内试验和体外试验。OECD于2004年首次颁布了这两种试验方法的标准。体外试验方法使用非活体皮肤如哺乳动物皮肤检测皮肤吸收放射性标记的化学物情况, 收集不同时间点皮肤另一侧液体分析化学物含量, 或使用有代谢活力的皮肤检测化学物扩散情况和代谢产物分布情况。虽然多数情况下进行体外皮肤吸收试验即可, 但是仍有必要了解化学物体内经皮吸收的情况。体内经皮吸收试验使动物皮肤接触放射性标记的化学物, 暴露结束时处死一组动物, 其余几组动物按照一定的时间间隔处死, 在暴露开始至处死前收集排泄物和呼出的气体分析放射性标记化学物的含量, 收集血以及接触化学物的皮肤组织, 获得动物体内化学物皮肤吸收的数据。

4 　体外皮肤腐蚀试验

经典的皮肤腐蚀试验需使用动物, 为避免动物遭受疼痛和伤害, 2004年OECD颁布了两个评估化学物皮肤腐蚀性的体外试验方法: 经皮电阻法和人皮肤模型法。这两个试验方法可有效识别腐蚀性化学物。OECD建议在进行活体动物试验之前先进行体外皮肤腐蚀试验。经皮电阻法使用取自于28～30 d的大鼠背侧皮肤组织, 试验用皮肤组织要求经皮电阻大于10 kΩ, 由于腐蚀性物质破坏角质层的完整性和屏障功能, 表现为皮肤经皮电阻低于一定的值(临界值一般为5kΩ) , 该试验方法测量皮肤组织与受试物接触24 h后的电阻评估化学物的腐蚀性。人皮肤模型法使用至少由表皮和角质层构成的立体皮肤模型, 化学物与皮肤组织接触一定时间后用生理盐水小心清洗皮肤表面, 腐蚀性物质通过腐蚀作用透过角质层对角质层下的细胞层产生细胞毒性, 导致细胞存活率下降。该试验应用四唑蓝还原试验(MTT reduction assay)测定细胞存活率评价化学物的腐蚀性。

5 　沉积物2水系统摇蚊毒性试验

OECD于2004年发布了评估化学物持续暴露对栖息于淡水2沉积物的双翅目昆虫摇蚊幼虫毒性的试验方法。主要过程是化学物加入试验系统的沉积物或水中, 待试验系统化学物浓度稳定后引入摇蚊一龄幼虫, 使一龄幼虫暴露于一定浓度的化学物, 试验周期根据不同的摇蚊而不同, C1riparius和C1yoshimatsui一般是20 ～28 d, 而C1tentans则为28 ～65 d。测定第10天幼虫存活率和体重情况, 试验结束测定摇蚊成虫数和发育率。应用回归模型估计引起幼虫存活率以及摇蚊成虫数或发育率降低X%的受试物浓度, 或采用统计假设检验确定NOEC /LOEC。

6 　化学物对土壤微生物氮转化活性影响试验

本试验方法研究化学物对土壤微生物氮转化过程的不良影响和估计化学物对土壤微生物菌落碳转化能力的影响, 获得化学物对土壤菌群的潜在有害效应的数据, 从而对化学物进行较全面的毒性特征评估。对于农药和非农药化学物采取不同的试验方案。在施用农药的前一天以及施用农药的第7、14和28天, 用适当的溶剂萃取施用农药的土壤和对照土壤,比较两组土壤的硝酸盐生成速率。试验需至少进行28 d。如第28天, 施用农药土壤的硝酸盐生成速率相对于对照组差异大于或等于25% , 试验需延长至最多100 d。如是非农药化学物, 添加一系列不同浓度的化学物于土壤中, 28 d后检测土壤的硝酸盐生成量。

鉴于我国毒理检测数据应达到可与OECD相互接受和认可试验室测试数据的等级要求, 能被欧盟国家主管当局认可接受, 我国应严格按照国际化学品健康危险检测要求, 采取切实步骤, 加强化学试验物检测能力建设, 建立相应的毒理学检测方法标准, 以便尽早满足国内危险化学物安全管理及毒理试验室检测化学品的需要。