中华人民共和国国家标准
工业循环冷却水中铁细菌的测定 MPN法 GB/T 14643.6-93
Industrial circulating cooling water-Examination of iron bacteria
—MPN test
1 主题内容与适用范围
本标准规定了工业循环冷却水中铁细菌的测定方法。
本标准适用于工业循环冷却水中铁细菌的测定，也适用于原水、生活用水及粘泥中的铁细菌的测定。
2 引用标准
GB 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备
GB 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 方法提要
本法采用多试管发酵技术，在29±1℃培养14d，如果试管内棕色消失而且形成褐色或黑色沉淀，表明阳性反应，采用MPN技术，对被测试样中的铁细菌进行计数。
4 试剂和材料
本试验方法中，除特殊规定外，应使用分析纯试剂和符合GB 6682中三级水规格的水。
4.1 硫酸镁(GB 671)； 4.2 硫酸铵(GB 1396)； 4.3 磷酸氢二钾(HG 3—1228)； 4.4 氯化钙； 4.5 硝酸钠(GB 636)； 4.6 柠檬酸铁铵； 4.7 氯化钠(GB 1266)； 4.8 氢氧化钠(GB 629)溶液：40g/L； 4.9 盐酸(GB 622)溶液:1+11； 4.10 硫代硫酸钠(GB 637)； 4.11 乙醇(GB 678)溶液：75%(V/V)； 4.12 牛皮纸； 4.13 医学脱脂棉。
5 仪器和设备
5.1 无菌箱(室)或超净工作台； 5.2 蒸汽压力灭菌器； 5.3 生化培养箱； 5.4 电热干燥箱：温度可控制在(60～280)±2℃； 5.5 刻度吸管：1mL； 5.6 刻度吸管：5mL； 5.7 试管：150mm×15mm； 5.8 试管架； 5.9 磨口三角瓶：100mL； 5.10 磨口试剂瓶：1000mL； 5.11 容量瓶：1000mL；
6 试验前准备
6.1 培养基的制备
称取下列试剂：
硫酸镁 0.5g；
硫酸铵 0.5g；
硫酸氢二钾 0.5g；
氯化钙 0.2g；
硝酸钠 0.5g；
柠檬酸铁铵 10.0g。
将上述试剂溶解在1000mL水中，用氢氧化钠溶液(4.8)或盐酸溶液(4.9)调节pH至6.8±0.2，并分装在试管中，每管5mL，塞上棉塞，数支一捆，每捆管口用牛皮纸包扎，用蒸汽压力灭菌121±1℃灭菌15min。
6.2 无菌稀释水的制备
6.2.1 生理盐水的配制：称取8.50g氯化钠溶解在1000mL水中，混匀。
6.2.2 将生理盐水(6.2.1)分装在100mL磨口三角瓶中，每瓶45mL。每个三角瓶塞和瓶口间插入一小纸片，塞紧瓶塞，每个瓶子的瓶口用牛皮纸包扎以防污染，用蒸汽压力灭菌121±1℃灭菌15min。
6.3 刻度吸管的灭菌。
6.3.1 将洗净并烘干后的刻度吸管粗端塞上医用脱脂棉，棉花量要适宜，长度大约10～15mm，棉花不宜露在口外，多余的棉花可以用火焰烧掉。
6.3.2 每支刻度吸管用一条约40～50mm宽的牛皮纸条，以45°左右角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，粗端用多余的纸条折叠打结，不使散开，标上量度，若干支扎成一束，置电热干燥箱中，于160±2℃灭菌2h。
6.4 采样瓶的灭菌
将洗净并烘干后的1000mL磨口试剂瓶瓶口和瓶颈用牛皮纸裹好，扎紧，置于电热干燥箱中，于160±2℃灭菌2h。
6.5 硫代硫酸钠灭菌
将硫代硫酸钠放入无菌箱(室)内，并均匀地摊在离紫外线灯30cm处，灭菌30min。
7 测定步骤
7.1 水样的采集
7.1.1 用无菌采样瓶采集被测样品，在采样过程中，要保护瓶口和颈部，防止这些部分受杂菌污染，瓶内要留下足够的空间，以备测定之前摇匀。
7.1.2 若采集的水中有余氯，应在采样前，在无菌操作下，于无菌采样瓶(6.4)中加入灭过菌的硫代硫酸钠(6.5)，加入的量为每升水样约0.1g。
7.1.3 水样采集后立即进行测定，如果在2h内不能进行测定，应把水样放在冰箱中，4～10℃保存，存放时间不宜超过24h。经冷冻保存后的水样需测定时，从冰箱中取出，30℃左右活化4～5h，再进行测定。
7.2 无菌箱(室)灭菌
把试验所用的无菌培养基、无菌稀释水、无菌吸管等用品放入无菌箱(室)，打开紫外线灯灭菌30min。
7.3 水样的稀释和接种
7.3.1水样放入灭过菌的无菌箱(室)(7.2)中，立即用75%(V/V)乙醇溶液的医用脱脂棉球擦手，点燃无菌箱(室)内的酒精灯。
7.3.2～7.3.6的操作应在无菌箱(室)内的火焰区进行。
7.3.2 选择适宜的稀释度，应使最后一个稀释度接种培养后无铁细菌生长，在空白稀释水样瓶(6.2)上标上稀释度数。
7.2.3 用10倍稀释法稀释水样，即用5mL无菌吸管(6.3)吸取5mL水样注入到45mL空白稀释水中充分摇匀，此时稀释度为10-1。
7.3.4 另取一支5mL无菌吸管吸取5mL稀释度为10-1水样注入到第二个稀释水中，充分摇匀，此时稀释度为10-2，依次类推，直至需要的稀释度为止。
7.3.5 将水样(包括稀释水样)分别接种于装有培养基的试管中(6.1)，试管置试管架上，每个稀释度重复接种5管(根据需要也可重复接种3管或4管)，每管接种1mL，每接一个稀释度更换一支无菌吸管。
7.3.6 另取一组试管培养基(6.1)不接水样，作为空白。
7.4 培养
在生化培养箱中29±℃培养14d。
8 计数与报告
8.1 凡产生褐色或黑色沉淀且原培养基中棕色消失变为透明状者，表明有铁细菌存在，以“+”(阳性)表示，其余试管以“-”(阴性)表示。
8.2 如果空白出现阳性反应，表明测定过程中有污染，本次测定无效。
8.3 算出10进位稀释管中阳性试管数，以阳性组合指数记录下来。
8.4 在10进位稀释中多于三个稀释度时，阳性合的指数只需要用其中依次的三个稀释度，对这三个稀释度的决定是先选出5管全部阳性反应的最大稀释度，然后选出其次相连的两个更高的稀释度，算出阳性组合指数(见表例1、2、4)。
8.5 若依照8.4所规定的原则选出三个稀释度后，有更高的稀释仍然产生一个阳性试管，就应该将这一个阳性试管并入所选择的最高稀释的阳性结果中(见表1例3)。
8.6 根据阳性组合的指数，查表(附录A)得出最大可能的菌数(MPN)除以阳性组合指数的第一位数字的稀释度数，即为每毫升水样中铁细菌的菌数(如果每个稀释度重复接种4管或3管，根据阳性组合的指数查附录B表B1或附录C表C1)。例表
例次
稀释度、生长情况及阳性试管数
阳性组合指数
报告方式
100
10-1
10-2
10-3
10-4
1
+++++
+++++
++---
-----
-----
520
5.0/10-1=50
5
5
2
0
0
2
+++++
++++-
++---
-----
-----
542
25/100=25
5
4
2
0
0
3
+++++
+++--
+----
+----
-----
532
14/100=14
5
3
1
1
0
4
+++++
+++++
+++++
+----
-----
510
3.5/10-2=3.5×102
5
5
5
1
0
9 精密度
9.1 由于微生物是不稳定的，精确的试验不能实现，精密度的表达仅能按MPN程序。
9.2 在样品中细菌的分布是不规则的，有时细菌成倍地吸附到小颗粒上，MPN正确度随着平行管的增加而增加，当使用5个平行管，每管加1mL样品时，测定结果的置信度为95%。
附 录 A
五个平行管最大可能的菌数
（补充件）
表A1
指数
个/ml
指数
个/ml
指数
个/ml
指数
个/ml
000
0.0
203
1.2
400
1.3
513
8.5
001
0.2
210
0.7
401
1.7
520
5.0
002
0.4
211
0.9
402
2.0
521
7.0
010
0.2
212
1.2
403
2.5
522
9.5
011
0.4
220
0.9
410
1.7
523
12.0
012
0.6
221
1.2
411
2.0
524
15.0
020
0.4
222
1.4
412
2.5
525
17.5
021
0.6
230
1.2
420
2.0
530
8.0
030
0.6
231
1.4
421
2.5
531
11.0
100
0.2
240
1.4
422
3.0
532
14.0
101
0.4
300
0.8
430
2.5
533
17.0
102
0.6
301
1.1
431
3.0
534
20.0
103
0.8
302
1.4
432
4.0
535
25.0
110
0.4
310
1.1
440
3.5
540
13.0
111
0.6
311
1.4
441
4.9
541
17.0
112
0.8
312
1.7
450
4.0
542
25.0
120
0.6
313
2.0
451
5.0
543
30.0
121
0.8
320
1.4
500
2.5
544
35.0
122
1.0
321
1.7
501
3.0
545
45.0
130
0.8
322
2.0
502
4.0
550
25.0
131
1.0
330
1.7
503
6.0
551
35.0
141
1.1
331
2.0
504
7.5
552
60.0
200
0.5
340
2.0
510
3.5
553
90.0
201
0.7
341
2.5
511
4.5
554
160.0
202
0.9
350
2.5
512
6.0
555
180.0
附 录B
四个平行管最大可能的菌数
（补充件）
表B1
指数
个/ml
指数
个/ml
指数
个/ml
指数
个/ml
000
0.0
113
1.3
231
2.0
402
5.0
001
0.2
120
0.8
240
2.0
403
7.0
002
0.5
121
1.1
241
3.0
410
3.5
003
0.7
122
1.3
300
1.1
411
5.5
010
0.2
123
1.6
301
1.6
412
8.0
011
0.5
130
1.1
302
2.0
413
11.0
012
0.7
131
1.4
303
2.5
414
14.0
013
0.9
132
1.6
310
1.6
420
6.0
020
0.5
140
1.4
311
2.0
421
9.5
021
0.7
141
1.7
312
3.0
422
13.0
022
0.9
200
0.6
313
3.5
423
17.0
030
0.7
201
0.9
320
2.0
424
20.0
031
0.9
202
1.2
321
3.0
430
11.5
040
0.9
203
1.6
322
3.5
431
16.5
041
1.2
210
0.9
330
3.0
432
20.0
100
0.3
211
1.3
331
3.5
433
30.0
101
0.5
212
1.6
332
4.0
434
35.0
102
0.8
213
2.0
333
5.0
440
25.0
103
1.0
220
1.3
340
3.5
441
40.0
110
0.5
221
1.6
341
4.5
442
70.0
111
0.8
222
2.0
400
2.5
443
140.0
112
1.0
230
1.7
401
3.5
444
160.0
附 录C
三个平行管最大可能的菌数
（补充件）
表C1
指数
个/ml
指数
个/ml
指数
个/ml
000
0.0
201
1.4
302
6.5
001
0.3
202
2.0
310
4.5
010
0.3
210
1.5
311
7.5
011
0.6
211
2.0
312
11.5
020
0.6
212
3.0
313
16.0
100
0.4
220
2.0
320
9.5
101
0.7
221
3.0
321
15.0
102
1.1
222
3.5
322
20.0
110
0.7
223
4.0
323
30.0
111
1.1
230
3.0
330
25.0
120
1.1
231
3.5
331
45.0
121
1.5
323
4.0
332
110.0
130
1.6
300
2.5
333
140.0
200
0.9
301
4.0
附加说明：
本标准由中华人民共和国化学工业部提出。
本标准由化学工业部天津化工研究院归口。
本标准由南京大学和南京中山水处理公司负责起草。
本标准主要起草人曾昭琪、丁美芳、解正宽、蒋振祥。
