卫消网:灭藻剂评价法的研究_叶绿素-小球藻--生长-浊度

[摘要] 选用小球藻作为实验藻种,对几种评价灭藻剂性能的方法进行了探讨,其中包括叶绿素法、抑藻圈法、藻细胞浊度法和显微计数法。结果表明:叶绿素法是比较方便、有效的评价方法。
[关键词] 杀菌剂;小球藻;评价方法
　近年来,环境污染问题越来越广泛地引起人们的关注。藻类污染作为环境污染的一部分,主要是由于工业废水和生活污水引起的水体富营养化造成的。在富含N、P 等营养元素的水体中,藻类过多的繁殖会破坏环境的生态平衡。在工业循环冷却水中,由于循环水中藻类等微生物的生长繁殖将会对工业生产产生不利的影响: 增加水流摩擦力,减少冷却水流量,降低热交换率;可能堵塞管道,造成垢下腐蚀穿孔,使设备报废;藻的生长还能为循环水中的好氧细菌的生长提供氧气,使循环水中的微生物繁殖更加旺盛。
　　目前有关灭藻剂的报道较少,还没有一个通用的、方便的评价灭藻剂的标准方法。本文选用生长较快的小球藻作为实验藻种,从几种常用的测定藻生长量的方法入手,筛选出一种方便有效的评价灭藻剂性能的方法,为进一步研究打下了基础。
1 　实验部分
1.1 　藻种来源
　　实验所选用的小球藻(属绿藻门) 是我国环保局推荐的作为环境监测的实验藻种。小球藻多生长在有机质丰富的淡水池塘中。将天然水体中采集的水样,在实验室条件下进行分离、纯化、制备、接种,得到实验用的小球藻。
　　文献报道,水生四号是培养小球藻效果较好的培养液,其配方如下:硫酸铵0. 200 g、过磷酸钙0. 030 g、硫酸镁0. 080 g、碳酸氢钠0. 100 g、氯化钾0. 025 g、氯化铁(1 %的水溶液) 0. 150 mL 、土壤水溶液0. 500 mL 和水1 000 mL 。以上药品配成溶液,高压灭菌(121 ℃,15 min) 后使用。
1.2 　实验方法
1.2.1 　叶绿素法
　　各种藻类都含有叶绿素a ,因此通过测定叶绿素a 的含量就可以测量出藻细胞的生长量。叶绿素的测定,有荧光法和比色法两种,本文采用了比色法,具体方法如下:
　　将培养物摇匀,取适量样品加0. 2～1. 0 mL 的碳酸镁悬浮液(1 000 mL 蒸馏水中加入1 g 碳酸镁配制而成) 。在减压(0. 05 MPa) 下用孔径为0. 45μm 的滤膜或玻璃纤维( GF/ A 或GF/ C) 收集细胞。也可将样品加入0. 2～1. 0 g 的碳酸镁悬浮液,转入离心管中,离心10 min (3 500 r/ min) ,去除上清液,收集细胞。
　　将收集到的细胞,转入匀浆器或研钵,加2～3mL 90 %的丙酮溶液(9 份体积的丙酮加一份体积的蒸馏水配制而成) ,在室温下研磨3 min。
　　将提取液转入有刻度的具塞离心管中,用约1mL 90 %的丙酮溶液洗匀浆器或研钵,并将洗涤液倒入上述离心管中,如此重复1～2 次,最后定容为10 mL ,离心3 min (3 500～4 000 r/ min) ,静置1～2min ,以上操作均需在暗处进行。
　　取上层清液,用光径为1 cm 的比色皿在750nm ,669 nm ,645 nm ,630 nm 波长处分别测定它们的光密度。结果如表1～表4 所示。为减少试剂以及操作引起的误差,取按上述过程制备的上清液(无培养物) ,作为比色测定时调节零点的空白对照。此外,为使0. 2 < OD663 < 1 ,应选用不同光径的比色皿或控制稀释度。叶绿素a 、b 和c 分别在663 nm ,645nm ,630 nm 波长处存在吸收峰值。在750 nm 处测得的OD 用于校正浊度。故在计算它们的含量时应对OD 先进行校正,即分别减去OD750 :
　　Ca = 11. 64 ( OD663) - 2. 16 ( OD645) + 0. 1 ( OD630)
　　Cb = 20. 91 ( OD645) - 3. 90 ( OD663) - 3. 66 ( OD630)
　　Cc = 54. 22 ( OD630) - 14. 81 ( OD645) - 5. 33 ( OD663)
式中, Ca 、Cb 、Cc 分别为提取液中叶绿素a 、b、c 的含量,g/ L ; OD645 、OD630和OD663均为校正后的OD 。
　　单位体积培养物中叶绿素a 的含量为:
　　叶绿素a 的含量= ( Ca ×提取液体积) / 过滤培养物体积
　　灭藻率= (对照样叶绿素a 含量- 实验样叶绿素a 含量) / 对照样叶绿素a 含量×100 %
1.2.2 　抑藻圈法
　　将纯化得到的小球藻培养至生长稳定期,接种到固体培养基上,并在接种后的培养基上放一个浸有灭藻剂的滤纸片,培养5～7 d。观察抑藻圈的大小,结果如表5 所示,抑藻圈大则相对应的灭藻剂的性能好,反之灭藻剂的性能不好。其步骤如下:　　(1) 固体培养基的制备。在配好的水生四号培养液中,加入2 %的琼脂制成固体培养基,对培养基和干净的平皿进行高压灭菌(121 ℃,151 min) 。倒平皿,冷却后待用。
　　(2) 接种涂平皿。取1 mL 藻细胞液接种到相应的固体培养基上,用涂布器涂布均匀。
　　(3) 制作抑藻滤纸。在直径为18 mm 的圆形滤纸上,滴0. 05 mL 的灭藻剂,即可使用。
　　(4) 将含灭藻剂的圆形滤纸片小心放在接种了藻的平皿中央,进行培养。
(5) 观察滤纸片以及周围藻细胞的生长抑制情况。抑制藻的生长表现为:滤纸片周围整个圈内无藻生长,显微镜下观察无藻落形成,或藻的叶绿素受到破坏。用刻度尺量出抑藻圈的大小。
1.2.3 　藻细胞浊度法
    藻细胞浊度法是评价藻细胞生长量的一个方便有效的方法。用721 分光光度计在663 nm 处测定小球藻细胞的浊度,能准确反映小球藻的生长量。当营养丰富,而没有其他限制因素时,小球藻的生长繁殖相当快,其繁殖细胞可用下列函数表示:
　lg( N/ N0) = Kt
　　小球藻在生长稳定情况下, K = 1. 19 ,每天细胞的增殖数为:
　　lg( N/ N0) = 1. 19 ×1
　　N = 15. 5 ×N0
　　也就是说,每个细胞每天分裂为16 个子细胞。
    用测定藻细胞浊度法来评价灭藻剂的性能,就是基于灭藻剂对藻细胞生长量的影响,对比加入灭藻剂后与对照样的生长量的差异。
1.2.4 　显微计数法
    在显微镜下计算单位培养液中藻细胞的个数,是测定藻细胞生长量的一个经典方法。用血球计数板计数藻细胞浓度时,可以区别死细胞和活细胞,死亡细胞通常只保持细胞的形状,而不能显现活细胞的亮绿色。
2 　结果与讨论
    对比上述四种实验方法不难发现:　　
    抑藻圈法可以很直观的看到灭藻剂的灭藻效果,但用固体培养基培养时,藻类生长速度慢,实验周期太长,而且固体培养条件与灭藻剂的实际应用条件不同,灭藻效率可能会受到灭藻剂挥发性的影响。
　　藻细胞浊度法是评价藻细胞生长量的一个有效方法,但在评价灭藻剂的性能时有明显的不足,灵敏度差,并有较大误差。其原因可能是:在测定藻细胞的生长量时,测定样中的藻细胞均为活细胞,而在评价灭藻剂时,死亡的藻细胞也同样会产生浊度。
　　显微计数法虽然是评价藻细胞生长量的经典方法,但在操作过程中存在一些困难。首先,在大量藻细胞聚集的情况下,难以保证微小的取样量具有足够的代表性;其次小球藻在生长时,特别是加入某些灭藻剂后,容易聚集成团,产生形体异样的藻细胞,给显微计数增加了难度。
　　由于所有的藻类细胞中都含有叶绿素a ,因此可以用测定叶绿素a 含量的方法来反映培养物藻细胞的多少。死亡细胞会被降解,也不会产生影响。因此叶绿素方法是一个有效的评价灭藻剂性能的方法。
　　在工业循环冷却水中不仅有藻类的生长,还存在其他微生物,因此在选择灭藻剂时,还要考虑到对其他微生物的杀灭情况,甚至还与药剂的价格等因素有关,而灭藻剂性能只是其中的一个主要方面。